پروتئین ها اجزای اساسی سلول ها ، بافت ها و ارگانیسم ها هستند. این ماکرومولکولها از رشته های طولانی اسیدهای آمینه که بطور اختصاصی در پیکربندی های سه بعدی قرار گرفته اند ساخته شده است. پروتئین ها هزاران مسیر بیوشیمیایی حاکم بر عملکرد یک ارگانیسم را آغاز و وساطت می کنند. مطالعه دقیق پروتئین ها می تواند اطلاعاتی در مورد عملکرد بدن ما ، مسیرهای بیماری و بیان کد ژنتیکی نشان دهد. اصلی ترین چالش برای مطالعه پروتئین ها ، انتخاب مناسب ترین روش برای استخراج پروتئین است.
از چه بافتی می خواهید پروتئین را جدا کنید؟ آیا شما علاقه مند به مطالعه پروتئین های سیتوزولی ، خارج سلولی یا ترشحی هستید؟ آیا می خواهید تعامل پروتئین با پروتئین بومی و ساختار سوم / ساختار چهار بعدی در طول استخراج پروتئین خود را حفظ کنید؟ آیا به طور خاص می دانید کدام پروتئین را می خواهید جداسازی کنید یا به دنبال یک نمونه گسترده هستید؟ هنگامی که نمونه خود را مشخص کردید می توانید روش استخراج پروتئین خود را متناسب با هدف آزمایش خود انتخاب کنید.
حتما قبل از این محتوا درباره سنجش پروتئین نیز بخوانید.
مراحل اولیه
مراحل اولیه استخراج پروتئین اغلب شامل تخریب مکانیکی خام مانند برش ، خردکردن یا برش بافت در قطعات کوچکتر است. اگر پروتئینهای داخل سلول هدف باشند ، می توان از مواد شوینده برای جدا کردن غشای سلولی فسفولیپید (لیز سلولی) استفاده کرد. برای ایجاد تخریب در غشاء از امواج فراصوتی نیز استفاده می شود. اغلب ، مهارکننده های پروتئاز برای جلوگیری از، از بین رفتن پروتئین به دلیل تخریب آنزیمی به مخلوط اضافه می شوند.
سانتریفیوژ
قطعات بزرگ بافت پس از تخریب در بافت اولیه خام به راحتی توسط سانتریفیوژ برداشته می شوند. سانتریفیوژ دیفرانسیل اغلب نقش مهمی در استخراج پروتئین دارد. سرعت و زمان سانتریفیوژ به طور انتخابی اندامکهای درون سلولی را به داخل گلوله می کشند. از این طریق پروتئین ها می توانند از طریق دورهای مختلف سانتریفیوژ از محفظه سلول خاص استخراج شوند. علاوه بر این ، اسیدهای نوکلئیک را می توان شیمیایی از دوغاب اولیه بافت رسوب کرد و با سانتریفیوژ برداشته شد.
از یک روش مشابه می توان برای رسوب پروتئین ها از روی ماده رویی استفاده کرد. تعامل و عملکرد پروتئین بسیار وابسته به ساختار سه بعدی است. این زنجیره های جانبی اسید آمینه ، جیب های شیمیایی واسطه را در اثر تداخلات آبگریز و آبگریزی از جمله اتصال هیدروژن ، یونی و نیروهای واندروالس فراهم می کنند. یکی از راه های ایجاد اختلال در این تعامل ها از طریق یک بافر نمک زیاد یا بافر pH بالا یا پایین است. وقتی پروتئین ها از محلول خارج شوند ، می توانند دور دیگری از سانتریفیوژ جمع شوند. این اختلال شیمیایی ممکن است برای اهداف تجربی که شامل بررسی اثر متقابل پروتئین پروتئین بومی باشد مناسب نباشد زیرا این روند با فرآیند استخراج مختل می شود.
استخراج پروتئین از طریق برهمکنش های شیمیایی
شیمی زنجیره جانبی اسید آمینه می تواند برای کمک به استخراج پروتئین مورد استفاده قرار بگیرد. یک مثال یک ستون تبادل یونی یا یک ستون آبگریز است. اسیدهای آمینه با زنجیره جانبی دارای بار مثبت (آرژنین ، هیستیدین و لیزین) ، زنجیره های جانبی با بار منفی (اسید آسپارتیک ، اسید گلوتامیک و یا دیگر اسید ها) و زنجیره های جانبی آبگریز (تیروزین ، تریپتوفان ، فنیل آلانین ، والین ، ایزولوسین و غیره) وجود دارد. این وابستگی ها به پروتئین ها اجازه می دهد تا به ستونی متشکل از یک ماتریس مثبت ، منفی یا آبگریز جذب شوند. پس از جذب شدن به ستون ، پروتئین ها را می توان به عنوان نمونه غنی شده شستشو داده و از بین برد.
روش های خاص تر استخراج پروتئین
استخراج پروتئین از طریق ستون سازی و ستون های میل ترکیبی روش های مؤثر برای جداسازی پروتئین های عمومی به صورت عمده است. با این حال ، اگر هدف آزمایشی شما مستلزم استخراج یک پروتئین خاص باشد ، پس روش های دیگری نیز وجود دارند که ممکن است مناسب تر باشند. این امر به ویژه برای استخراج آنتی بادی یا آنتی ژن مفید است زیرا این پروتئین ها وابستگی های خاصی به یکدیگر دارند.
استخراج آنتی بادی های IgG ممکن است از طریق میل پروتئین A / G انجام شود. از طرف دیگر ، با اتصال آنتی ژن مربوط به یک سطح جامد مانند ستون یا مهره می توان آنتی بادی های خاص را جدا کرد. به طور مشابه ، استخراج یک آنتی ژن خاص با استفاده از آنتی بادی های حاوی یک سایت تشخیص برای آنتی ژن می تواند تکمیل شود. این فرآیند با استفاده از نانوذرات ابرپارامتیکی کاربردی و جداسازی بیومغناطیسی سریع ، آسان و کارآمد صورت می گیرد.
کاربرد پروتئین های استخراج شده
به عنوان یکی از مولکولهای بسیار مورد مطالعه در تحقیقات بیولوژیکی ، استخراج پروتئین کاربردهای گسترده ای دارد. از محصولات تجاری گرفته تا تحقیقات ، اولین مرحله تمیز کردن پروتئین به طور کامل است. فرآیند تصفیه پروتئین مراحل زیادی را قبل از استفاده پروتئین نیاز دارد.
تشخیص حضور پروتئین به دلیل کوچک بودن اندازه آنها ، یک مسئله چالش برانگیز است. روشهای تشخیص کل پروتئین شامل جذب ، استفاده از آمیدو سیاه یا کلوئیدی طلایی ، تشخیص نیتروژن و سنجش هایی از جمله پروتئین Bradford است. روش های خاص مقادیر موجود در یک پروتئین واحد را تشخیص می دهد. مهمترین روشها ، روشهای طیف سنجی و وابسته به آنتی بادی هستند.
کاربردهای بالینی
در کاربردهای بالینی می توان از جداسازی پروتئین ها در تشخیص بیماری ها استفاده کرد. به عنوان مثال ، وجود انسولین در ادرار می تواند شاخصی برای دیابت باشد. علاوه بر این ، پروتئین های خالص اغلب در درمان بیماری و یا در روش های آرایشی مانند استفاده از کلاژن برای مراقبت از پوست بسیار حیاتی هستند.
کاربردهای تحقیقاتی
در تحقیقات ، چندین کاربرد پایین دست برای تصفیه پروتئین وجود دارد که نیاز به استخراج جلا داده شده با کیفیت بالا دارند ، که چندین مورد از آنها روش های تشخیص هستند.
Immunoprecipitation (IP)
این فرآیند یک آنتی ژن از آنتی بادی های پروتئین بی حرکت ایجاد می کند و آن را از محلول با استفاده از یک پشتیبانی جامد می کند. این روش در ابتدا با استفاده از رزین آگارز توسعه یافته است ، اما روشهای جدید تصفیه از دانه های مغناطیسی به دلیل افزایش سرعت ، راحتی و اتوماسیون استفاده می کنند. IP اغلب اولین قدم قبل از تکنیک های سنجش یا بلات کردن است.
پروتئین شناسی
پروتئوم یک ارگانیسم مجموع پروتئین هایی را که می تواند ایجاد یا استفاده کند ، توصیف می کند. مطالعات پروتئینی در انسان بر شناسایی کلیه پروتئین های موجود در بدن انسان و همچنین کمیت ها ، عملکرد و ساختار آنها تمرکز دارد. این به سریعتر یافتن پروتئین های مورد علاقه کمک می کند.
سنجش آنزیم
اغلب برای شناسایی هویت حضور آنزیم خاص یا تعیین مقدار آنزیم های کل / خاص موجود انجام می شود ، سنجش ها در اندازه گیری فعالیت آنزیمی بسیار مهم هستند. آزمایش ها می توانند مداوم یا ناپیوسته باشند ، و اغلب مجبور هستند عوامل مخدوش دقیقی مانند pH یا دما را کنترل کنند.
روش استخراج پروتئین
تمام مراحل استخراج پروتئین از سلول ها یا بافت (تازه یا یخ زده) باید در دمای 2-8 درجه سانتیگراد انجام شود. در زیر ترکیب یک بافر لیز رایج است که برای تهیه نمونه های پروتئین استفاده می شود.
تهیه محلول بافر
- بافر RIPA برای استخراج پروتئین محلول آماده استفاده
- NaCl 150mM
- Triton X-100 1٪
- دیوکسی کلات سدیم 5٪
- SDS1٪
- Tris-HCl pH 8.0 ، 50 میلی‌متر
- مهارکننده های پروتئاز
مراحل استخراج پروتئین
- محیط موجود در ظروف کشت را با سلول ها دور ریخته و سلول ها را با استفاده از PBS بشویید.
- PBS را دور بریزید ، بافر لیز یخ زده را اضافه کنید.
- سلول ها را با استفاده از لیسه سلولی پلاستیکی سرد جدا کنید. سلول ها را در لوله های میکروفاژ جمع کنید.
- به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد ، محتویات موجود در لوله های میکروفاژ را بریزید.
- لوله ها را با دمای 16000 درجه به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. رویی را روی لوله تازه جمع کرده و روی یخ قرار دهید. گلوله ها را دور بریزید.
استخراج پروتئین از سلولهای در حالت شناور
- سیستم شناور سلول را در 2000G به مدت 5-7 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. سلول ها در انتهای لوله جمع‌آوری می شوند ، لایه رویی را دور بریزید.
- به گلوله سلولی ، PBS سرد یخ را اضافه کنید و سلول ها را با استفاده از سانتریفیوژ در 2000G به مدت 5-7 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد ، سلول ها را بشویید.
- بافر لیز سرد یخ را به گلوله سلول اضافه کنید. به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد ، محتویات موجود در لوله های میکروفاژ را بریزید.
- لوله ها را با دور 16000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. رویی را روی لوله تازه جمع کرده و روی یخ قرار دهید. گلوله ها را دور بریزید.
استخراج پروتئین از بافت ها
- بافت مورد علاقه یخ را جدا کنید. با غوطه وری در نیتروژن مایع ، بافت را به لوله های میکرو فوج گرد منتقل کنید و با آب غوطه ور کنید.
- برای بافت 5 میلی گرم ، 300 میکرولیتر بافر لیز یخ را اضافه کرده و با استفاده از هموژنایزر برقی همگن کنید. در حین همگن شدن 300-600 میکرولیتر لیتر بافر لیز اضافه کنید.
- محتویات را به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار دهید.
- لوله ها را با دور 16000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. رویی را روی لوله تازه جمع کرده و روی یخ قرار دهید. گلوله ها را دور بریزید.
تعیین غلظت پروتئین کل را در نمونه ها
- برای انجام آزمایش تخمین پروتئین حجم کمی از لیزات مصرف کنید.
- تخمین پروتئین ممکن است با استفاده از معرف پروتئین سنجش Coomassie ، سنجش BCA یا جذب در 280 نانومتر انجام شود.
- غلظت پروتئین نمونه های ناشناخته را با مقایسه با استانداردها مشخص کنید و اطمینان حاصل کنید که استاندارد در همان بافر نمونه های ناشناخته رقیق می شود.
- حجم مناسب لیزها را به لوله های میکروفاژ منتقل کنید تا تمام نمونه ها دارای غلظت پروتئین کل باشند.
- بافر لیز کافی برای سرد کردن یخ را اضافه کنید تا تمام لیزها به همان حجم تشکیل شوند.
در آخر این نمونه ها را برای الکتروفورز استفاده می کنیم.
منابع
https://www.biochain.com/general/protein-extraction-methods/
جلسه های مشاورتون واقعا تاثیر گذارند
دستخوش
آقا نیک نام فوق العادن
میتونیم توی سایت شما مطلب بنویسیم؟
مطلبتون بسیار مفید بود
بیشتری بنویسین لطفا
گروه واتساپی هم دارید؟
مشاوره ازدواج هم هست
مشاوره آنلاین از چه طریقی صورت می گیره؟
چرا اینقد کم؟
عاااااااااااالی بود